铁死亡是一个复杂的过程，选择性诱导铁死亡已被用作某些癌症的潜在治疗策略。然而，当静脉注射铁死亡诱导剂时，它们会不加区别地攻击全身细胞，可能引起严重的毒副作用……
核心要点：
(1) 在铁死亡诱导剂 (RSL3) 存在的情况下进行了全基因组 CRISPR-Cas9 筛选，鉴定出参与铁死亡的关键驱动基因 ALOX15 (一种关键的脂氧合酶)。
(2) saRNA 介导的 ALOX15 激活通过脂质过氧化的快速放大产生致命水平的毒素来促进铁死亡。
(3) 开发了一种靶向神经胶质瘤的巨噬细胞膜 (MM) 包被 + saALOX15 负载的基于介孔聚多巴胺 (MPDA) 的纳米颗粒 (NPs) --- Ang-MMsaNPs。Ang-MMsaNPs 表现出免疫伪装，使 NPs 能够避免单核吞噬细胞系统 (MPS) 的吞噬，并促进胶质母细胞瘤 (GBM) 对 NPs 的摄取，从而促进 GBM 细胞的铁死亡。
(4) Ang-MMsaNPs 在体内和体外表现出良好的靶向性，显著延缓小鼠 GBM 的进展，并增强放射治疗 (RT) 的效果。
大规模 CRISPR 功能丧失基因组筛选是识别肿瘤发生相关基因和通路的有效策略。研究团队使用了基于 CRISPR-Cas9 敲除文库的全基因组筛选和 RSL3 抗性细胞系的转录组分析的组合策略 (图 1A)。根据比较，两个基因 (ALOX15 和 PCBP1) 在两个数据集中重叠，并且与 GBM 中的铁死亡相关。
图 1. 全基因组 CRISPR-Cas9 文库筛选和 RNA 测序确定了 ALOX15 是神经胶质瘤铁死亡的重要驱动因素[1]。
(A) 实验设计示意图。(B) 非复发和复发患者标本中 ALOX15 的 IHC 染色的代表性图像。(C) Pearson 相关分析显示 ALOX15 的表达与4-HNE的表达呈正相关。(D) Kaplan-Meier 对 ALOX15 低表达与高表达的神经胶质瘤患者生存时间的估计。
此外，基于各种数据集 (包括 TCGA、Gravendeel 和 Rembrandt 数据库以及神经胶质瘤组织微阵列数据) 中 GBM 患者的 ALOX15 表达下降与不良预后之间存在的显著相关性 (图 1B)。选定 ALOX15 在 6 个神经胶质瘤样本进行 RNA 测序分析，同时用抗 ALOX15 和抗 4-HNE (铁死亡细胞标记物) 抗体对 180 个胶质瘤样本的组织微阵列进行染色。结果显示在复发的神经胶质瘤患者中观察到 ALOX15 水平下降 (图 1C-D)。
小激活 RNA (saRNA) 通过将内源转录复合物招募到靶基因来发挥作用，从而导致 mRNA 表达增加和靶蛋白上调。
图 2. SaALOX15 介导的 ALOX15 激活促进 GBM 细胞中的铁死亡[1]。
(A) 活细胞和死细胞的检测。(B) 共聚焦显微镜观察到 JC-1 染色后 LN229 细胞中 MMP (Δψm) 的变化。
研究团队设计了 saALOX15-3 来上调 ALOX15，当 GBM 细胞暴露于 saALOX15 (指 saALOX15-3) 时，观察到铁死亡细胞死亡，并且这种效应被铁死亡特异性抑制剂 ferrostatin-1 减弱 (图 2A)。同时，saALOX15 处理显著增加了氧化脂质的比例和脂质活性氧 (ROS) 水平。此外，JC-1 染色表明，saALOX15 处理后线粒体膜电位 (MMP, Δψm) 显著减弱，绿红荧光比率增加 (图 2B)。
Ang-MMsaNPs 的构建过程 (图 3A)：(i) 制备负载 saALOX15 的 MPDA NPs
(ii) 分离 Angiopep-2 修饰的 MM
(iii) 用 Angiopep-2 修饰的 MM。
备注：经多方面验证，天然巨噬细胞膜成功易位并保留在 Ang-MMsaNPs 表面上。透射电子显微镜图像证实 Ang-MMsaNPs 表现出均匀的“核-壳”形态 (图 3B)。
室温下长期储存，Ang-MMsaNPs 具有良好稳定性，并表现出持续释放作用。MPDA-NP 与 MM 成功包封形成 Ang-MMsaNP，而且还保留了 MM 组成和保留的肿瘤靶向性特征，以促进其瘤内递送。
图 3. Ang-MMsaNP 的合成和表征[1]。
(A) Ang-MMsaNPs 的构建示意图。(B) 纯化纳米粒子的透射电子显微镜图像。(C) 通过共聚焦显微镜观察 LN229 细胞中 Ang-MMsaNP 的体外内体逃逸能力。
此外，绝大多数纳米材料在经内吞作用进入到细胞后，均会经过内体-溶酶体运输途径发生降解，从而失去其原本作用。因此，纳米材料必须规避内体/溶酶体降解，成功逃逸至细胞质中，这种现象就称之为内体/溶酶体逃逸。
通过共聚焦显微镜检查了 LN229 细胞中 Ang-MMsaNPs 的体外内体逃逸能力。孵育 3 小时后，Ang-MMsaNPs 显示出与溶酶体的高度共定位。孵育 6 小时后，大多数 Ang-MMsaNPs 和溶酶体没有重叠，这表明 Ang-MMsaNPs 随着时间的推移从溶酶体中逃逸 (图 3C)。
一般来说，死细胞、细胞碎片和外来颗粒通过循环单核细胞和其他细胞的有效吞噬作用被清除。多项研究表明，MM 涂层纳米粒子通过 MPS 抑制吞噬作用。同样地，Ang-MMsaNPs 也可以逃脱 MPS 介导的吞噬作用，从而在体内表现出增强的肿瘤靶向特异性 (图 4A)。
图 4. Ang-MMsaNPs 逃离 MPS 并有效地靶向并在 GBM 中积聚[1]。
（A）作者将 Indocyanine green（ICG）标记的 MPDA-NPs 和 Ang-MMsaNPs 通过尾静脉注射到小鼠体内。结果表明，当用 Ang-MMsaNP 处理小鼠时，循环 ICG +单核细胞数量减少(表明逃脱吞噬作用)。（B）注射 ICG 标记的 MPDA-NP 和 Ang-MMsaNP 后原位 LN229 裸鼠和主要器官的荧光图像。与 MPDA-NPs 相比，Ang-MMsaNPs 在肝、肺、心、肾、脾中的分布显著减少，而在脑中的分布显着增加。
同时，体外共聚焦显微镜分析表明，Ang-MMsaNPs 比 MPDA-NPs 表现出明显更有效的 BBB 渗透和更强的靶向 LN229 细胞的能力。将 Indocyanine green (ICG) 标记的 MPDA-NPs 和 Ang-MMsaNPs 通过尾静脉注射到小鼠体内。注射 Ang-MMsaNPs 的原位 LN229-Luc 荷瘤小鼠表现出强烈的 ICG 荧光，显示有效的 BBB 穿透和肿瘤积累和保留 (图 4B左)。此外，MM 包覆的 NPs 减少了 NPs 在体内主要器官的积累，降低了 MM 包覆的 NPs 的非特异性毒性和副作用 (图 4B右)。
通过钙黄绿素-AM (Calcein AM) 和碘化丙啶 (PI) 染色测定 Ang-MMsaNPs 的铁死亡促进作用，与其他组相比，Ang-MMsaNPs 组发出的主要是红色信号，很少有绿色信号 (图 5A)。在患者来源的 GBM 类器官 (PDO) 中进行 Ang-MMsaNPs 治疗后，PI 阳性群体也有所增加 (图 5B)。同样，Ang-MMsaNPs 促进铁死亡功能，包括大量脂质过氧化 (图 5C)、丙二醛 (MDA) 和脂质 ROS 积累。
图 5. Ang-MMsaNP 的体外治疗效果[1]。
(A) Ang-MMsaNPs 处理后活细胞和死细胞的检测。(B) Ang-MMsaNPs 处理后 PDO 中活细胞和死细胞的检测。(C) 共聚焦显微镜观察了 Ang-MMsaNPs 处理后脂质过氧化的变化。
原位携带 GBM 的小鼠被随机分组，每 3 天尾静脉注射 Ang-MMsaNPs、Ang-MMncNPs 或 PBS，并使用体内生物发光成像评估肿瘤生长 (图 6A)。Ang-MMsaNPs 处理的小鼠表现出明显的肿瘤抑制作用 (图 6B)，小鼠存活时间也显著延长。
图 6. Ang-MMsaNPs 对原位 GBM 小鼠的体内治疗效果[1]。
(A) 接受 NP 治疗的 LN229 原位肿瘤模型的示意图。(B) 指定治疗后小鼠的荧光素酶发光水平。(C) Western blot 检测 NPs 处理后肿瘤细胞中 saALOX15 的过表达效率。(D,E) NPs 处理后肿瘤组织中 ALOX15、ACSL4 和 4-HNE 表达的 IHC 分析。(F) NPs 处理后肿瘤组织中 MDA 的表达水平。
Ang-MMsaNP 处理后 ALOX15 蛋白表达水平显著增加 (图 6C)，肿瘤异种移植模型的脂质过氧化率增加 (图 6D-E)，ALOX15 的过度表达导致 MDA 水平升高，显示出最有效的铁死亡诱导作用 (图 6F)。此外，在原位 GBM 模型中，RT + Ang-MMsaNPs 联合治疗比其他治疗更有效。为了研究 Ang-MMsaNPs 如何导致 GBM 细胞铁死亡，进行了全局转录组分析，众多数据都指向了 Ang-MMsaNPs 治疗后的线粒体功能障碍。作者进一步评估了Ang-MMsaNPs 处理后 MMP (Δψm) 的变化、线粒体脂质过氧化水平和线粒体 ROS 水平，众多结果均与铁死亡细胞中异常的线粒体功能一致。除了线粒体功能障碍之外，电子显微镜观察到线粒体严重变形，Ang-MMsaNPs 治疗组的线粒体脊较少，这是铁死亡的特征。此外，使用了一种线粒体靶向抗氧化剂 (Mito-TEMPO)，发现 Mito-TEMPO 减轻了 Ang-MMsaNP 诱导的铁死亡和脂质过氧化。总之，Ang-MMsaNPs 通过促进线粒体损伤来诱导 GBM 铁死亡。
本期小 M 为大家介绍了仿生巨噬细胞膜与纳米颗粒的 “组合”--Ang-MMsaNPs，其通过促进胶质母细胞瘤线粒体损伤来诱导铁死亡。仿生纳米颗粒表现出良好的安全性，即使长期给小鼠服用也不会引起任何明显的副作用。因此，Ang-MMsaNPs 是一种潜在的纳米载体，有望成为治疗 GBM 的有效靶向药物递送系统。
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[1] Cao Z, et al. Biomimetic Macrophage Membrane-Camouflaged Nanoparticles Induce Ferroptosis by Promoting Mitochondrial Damage in Glioblastoma. ACS Nano. 2023 Dec 12;17(23):23746-23760.